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菠菜是一种重要的世界性绿叶蔬菜，生育期短，叶酸含量丰富，研究菠菜叶酸积累调控规律，对选育高叶酸菠菜品种具有重要意义，已知GTP环化水解酶Ⅰ和蝶呤醛还原酶在植物叶酸积累中发挥重要作用。

然而叶酸缺乏现象在许多国家普遍存在，由于日常叶酸摄入主来来自植物作物，而且由于人体利用化学合成叶酸需要一系列的代谢反应，摄入过量化学合成叶酸会导致人体中未代谢的非天然叶酸积累，从而可能增加维生素B12缺乏、白血病、关节炎和肠癌的患病风险以及导致异位妊娠的早期血液学表现难以检测，因此培育富含天然叶酸作物可以作为改善叶酸缺乏问题的一种低成本、可持续的策略。

叶酸对菠菜的基因的合成与代谢途径

在植物中，叶酸在植物细胞的细胞质与细胞器中合成。首先在细胞质和叶绿体中合成蝶呤和pABA，随后前体分子进入线粒体中组装并添加谷氨酸尾，然后可以储存在细胞质、液泡和叶绿体中。

此外，合成代谢途径还涉及叶酸的降解和回补。在蝶呤合成途径中，GTP环化水解酶I（GCH1）作为该通路的第一个催化酶，将GTP转化为二氢新蝶呤三磷酸（DHNTP）。GCH1作为叶酸合成途径中的限速酶，调控了合成通路的效率。

随后Nudix酶催化DHNTP去磷酸基团得到二氢新蝶呤（DHN），该酶表现出Mg2+依赖性，对DHNTP表现出特异性焦磷酸水解酶活性。最后二氢蝶呤醛缩酶（DHNA）催化DHN的侧链断裂，生成6-羟甲基二氢蝶呤（HMDHP）和羟基乙醛。

与其它产生叶酸的生物一样，植物通过两个步骤合成pABA。这两个步骤都定位在质体中，第一步由氨基脱氧胆酸合成酶（ADCS）将分支酸催化为氨基脱氧胆酸（ADC），随后再由氨基脱氧胆酸裂解酶（ADCL）将ADC裂解为pABA与丙酮酸。ADCS是一种双功能蛋白，具有两个亚基，分别是谷氨酰胺氨基转移酶（GAT）和ADC合成酶，两个亚基可以单独进行反应，但不能达到最大活性。

叶酸作为菠菜重要的代谢产物，在人类膳食营养及植物生长发育中起重要作用，但目前关于菠菜叶酸转录调控的研究仍不清楚。因此本课题以在前期筛选的菠菜叶酸积累关键基因SoGCH1、SoPTAR基础上，利用酵母单杂交技术筛选SoGCH1和SoPTAR的启动子结合蛋白，并通过双荧光素酶报告系统及表达谱对候选结合蛋白的转录调控功能进行验证，阐明调控因子对SoGCH1和SoPTAR表达的影响机制。

菠菜的SoGCH1与SoPTAR目的基因克隆

以菠菜S4cDNA为模板，按照pGADT7多克隆位点及插入基因的CDS序列利用PrimerPremier5.易购体育0软件设计加尾引物，使用TakaraPrimeSTAR®GXLDNAPolymerase进行PCR扩增，反应体系与程序如表5和表6所示，PCR扩增后续切胶回收步骤与2.IM体育3.3.1相同。

将上述DNA回收产物与载体pGADT7分别用相应的酶双酶切，内切酶与酶切体系依照表15和表10。酶切后用PCR产物回收试剂盒获得基因与线性化载体，利用T4连接酶将两者连接，利用冻融法将5μL连接产物转入大肠杆菌Trans-T1中，涂布于LB固体平板（100μg/mLAmp抗性），37℃过夜。以上连接、转化以及后续菌液PCR鉴定（引物使用pGADT7通用引物，参考2.3.4.6.2）、测序与质粒提取操作参照2.3.3.1。

SoGCH1、SoPTAR启动子克隆与生物信息学分析

根据拟南芥GCH1与PTAR序列在菠菜基因组数据库中比对获得的SoGCH1与SoPTAR序列，在其转录起始位点上游选取2000bp作为候选启动子序列。根据设计的引物进行PCR扩增，得到约2000bp的条带。

将PCR产物切胶回收后，与pEASY-Blunt载体连接并转化Trans-T1，菌液送公司测序，测序结果与菠菜基因组数据库的序列一致，将测序正确的菌液提取质粒并命名为pSoGCH1和pSoPTAR。

通过NCBI上的信息，将ATG上游第一个碱基定义为-1，经过在线预测发现SoGCH1与SoPTAR启动子含有真核生物转录起始所必须的核心元件TATAbox以及其它调控元件。

不同物种的GCH1启动子区域共包含138个顺式作用元件，在主要组成元件中，光响应元件（78个）数目最多，占总元件数的57％，其中最多的是Box4（16个）和G-Box（14个）；相比于其它物种，菠菜含有最多的光响应元件，共20个。

其次是激素响应元件（29个），占总数的21％，其中茉莉酸（JA）响应元件CGTCA-motif数目（16个）显著多于其它激素响应元件；SoGCH1启动子片段激素与JA响应元件数也大于其它元件，除JA响应元件外，还包含生长素（Auxin）、水杨酸（SA）和生长素（ABA）响应元件。

逆境胁迫响应元件中缺氧胁迫元件ARE数目最多，其次是低温与干旱响应元件等；除缺氧胁迫外，SoGCH1启动子还包含低温诱导元件LTR。

PTAR启动子分析结果显示主要包含区域共包含123个顺式作用元件，在主要组成元件中，光响应元件（53个）数目较多，占总元件数的43％，其中最多的是G-Box（9个）；AtPTAR启动子区光响应元件最少，菠菜含有最多的G-Box。

其次是激素响应元件（38个），占总数的31％，其中ABA响应元件ABRE数目（14个）最多；SoPTAR启动子片段包含ABRE（8个）数目显著多于其它物种，除ABA响应元件外，还包含Auxin和SA响应元件。最后是逆境胁迫响应元件（18个），按数目排列依次是缺氧（9个）、干旱（5个）、低温（3个）与防御应激响应元件（1个）；SoPTAR启动子区低温诱导元件LTR数目仅低于甜菜。

将菠菜cDNA载体文库（图A）分别转入Y1HGold（pBait-AbAi）诱饵菌株（图B）中，涂布相应浓度的SD/-Leu/AbA100固体培养基（图C）后挑取酵母阳性单克隆，二次划线验证（图D），菌落长出后用pGADT7通用引物进行菌落PCR（图E），将条带清晰单一的PCR产物送至生工进行测序。

将测序结果在菠菜基因库进行Blast比对分析，初步筛选到与SoGCH1、SoPTAR相关的阳性克隆数目分别为115和252，排除重复序列后为75和149，使用PlantTFDB在线网站（http:IM电竞官网//planttfdb.gao-lab.org/blast.php）对序列功能进行初步预测，发现17个蛋白可能为转录因子。

菠菜SoAHL基因家族成员系统发育与理化性质

在菠菜中共鉴定出了18条SoAHL家族基因，通过CDD初步预测（表20）其保守结构域以判断筛选结果是否可信，结果显示这些蛋白序列都含有AHL基因家族的典型保守结构域PCC/DUF296（G-R-F-E-I-L）。

将菠菜和拟南芥AHL序列共同构建进化树（图1），结果显示SoAHL成员被聚为AHL-A/TypeⅠ和AHL-B2个分支。拟南芥A亚族与B亚族分别含有14与15个成员，菠菜不同亚族各包含9个基因，亚族基本各占总数的50％，未见明显差异，表明A与B亚族在植物生长发育中可能占据同样重要的地位。

B亚族因为成员内所含AT-hook基序数量不同又被分为TypeⅡ和TypeⅢ两个小分支。菠菜中TypeⅡ和TypeⅢ分支各含3个与6个成员，拟南芥中则是6个与9个。菠菜（17％）TypeⅡ在AHL中占比略小于拟南芥（20％），在发育过程中可能出现了缺失。

分析SoAHL基因家族成员理化性质及亚细胞定位，结果显示SoAHLs基因中，SoAHL1定位于1号染色体，4个基因定位于2号染色体，SoAHL18基因定位于3号染色体，SoAHL3、SoAHL4以及SoAHL10定位于4号染色体，3个基因定位于5号染色体，6号染色体上含有最多的SoAHL基因，共6个。菠菜AHL基因家族成员在细胞核中全部表达；且分别有3个基因和2个基因在叶绿体和细胞膜中也有较高程度的表达，而在细胞质中表达的仅有SoAHL13。

菠菜SoGCH1和SoPTAR的生物信息学分析

GCHI催化了植物叶酸前体HMDHP合成的第一步，是决定整个叶酸生物合成过程效率的关键酶，在叶酸的代谢工程中被普遍研究，已有结果表明过表达GCHI的基因可以显著提高番茄、菜豆和莴苣的总叶酸水平，显示出GCH1在植物叶酸积累中的重要作用。

PTAR存在于叶酸回补途径中，能够将叶酸裂解产物DHPA还原为HMDHP，后者作为叶酸合成前体进入线粒体中参与叶酸再合成。PTAR对于叶酸的积累非常重要，因为DHPA若发生进一步不可逆的氧化则会脱离叶酸合成通路。

本实验室前期研究表明PTAR基因影响菠菜的叶酸积累水平，将SoPTAR基因在拟南芥中过表达后，转基因植株叶片的叶酸含量提高1.3倍，而在菠菜叶片过表达SoPTAR也使叶酸水平上升2.5倍。

经对菠菜的GCH1和PTAR进行启动子生物信息学分析，结果显示不同物种的GCH1与PTAR启动子区均含有较多的光调控元件、激素响应元件以及少量的逆境胁迫响应元件，表明GCH1的表达可能受光、激素和环境的综合调控。

关于光照能有效提高叶酸水平，目前已有研究证明，例如当栽培条件为25℃，照射红光，光照强度为200µmol·m-²·s-1时，生菜叶酸含量最高，秋季使用70％红光和30％蓝光处理时，也能使生菜叶酸水平达到峰值。

总结

在前期SoGCH1与SoPTAR研究基础上，利用酵母单杂交试验筛选SoGCH1与SoPTAR启动子结合蛋白，并通过双荧光素酶报告系统试验验证其功能，进一步明确SoGCH1与SoPTAR上游因子对其表达发挥的调节作用，结果将有助于阐明在菠菜叶酸合成与回补途径中的作用机制，对菠菜叶酸含量提升与品种改良具有重要的科学和实践意义。

SoGCHI基因核心启动子区域在-1177~-1227bp之间，SoPTAR核心启动子区域在-720~-770bp之间，它们的启动子都包含大量的光响应元件、激素响应元件以及非生物胁迫相应元件。基因家族分析结果显示菠菜基因组包含18个AHL成员与15个HMG成员。

SoAHL10启动子较其它B亚族成员启动子含有较多光、ABA及SA响应元件，可能参与光及激素响应的叶酸合成调控。SoHMGA是菠菜15个HMG成员一员，为菠菜HMGA亚族唯一成员，无内含子，含有H15结构域和3个AT-hook基序，其启动子上游含有较少光响应元件、激素（茉莉酸、脱落酸和水杨酸）及非生物胁迫（缺氧和低温）响应元件。